Reassessing the Role of Type II Toxin-Antitoxin Systems in Formation of Escherichia coli Type II Persister Cells

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Goormaghtigh F, Fraikin N, Putrinš M, Hallaert T, Hauryliuk V, Garcia-Pino A, Sjödin A, Kasvandik S, Udekwu K, Tenson T, Kaldalu N, Van Melderen L.

mBio. 2018 Jun 12;9(3):e00640-18.

doi: 10.1128/mBio.00640-18. PMID: 29895634; PMCID: PMC6016239.

Reassessing the Role of Type II Toxin-Antitoxin Systems in Formation of Escherichia coli Type II Persister Cells | mBio
Persistence is a reversible and low-frequency phenomenon allowing a subpopulation of a clonal bacterial population to survive antibiotic treatments. Upon remova...

 タイプII 毒素-抗毒素(toxin-antitoxin: TA)システムは、毒性タンパク質と抗毒素タンパク質をコードする小さなオペロンが緊密な複合体を形成して毒素の活性を阻害するシステムである。毒素の大部分はタンパク質合成阻害剤であり、様々な分子機構を用いて翻訳の各ステップを標的としている。抗毒素タンパク質は、ATP依存性プロテアーゼ(Lon、ClpXP、ClpAPなど)によって分解される。TAシステムの発現は、転写レベルで厳密に制御されている。定常状態では、TA複合体は負の転写制御因子として働き、オペロンプロモーターにあるパリンドローム配列と結合する。毒素レベルが抗毒素レベルよりも高い条件下では、抗毒素過剰な状況に回復させるためにオートレギュレーションを緩和する。

 タイプIIのTAシステムは、バクテリアのゲノムに広く豊富に存在する。TAシステムは、予測されるオープンリーディングフレーム全体の3%を占める場合もあり、90以上のTAシステムを含むゲノムもある。このような観察結果は、「なぜこれほど多くのTAシステムが存在するのか、何のために存在するのか」という本質的な疑問を提起する。これらの疑問にはほとんど答えられておらず、細菌の生理機能における染色体にコードされたTAシステムの役割については、この分野で大いに議論されている。

 タイプIIのTAシステムは、1980年代半ばにプラスミド上で初めて発見された。その機能は、細胞分裂の際にプラスミドのコピーを受け取らなかった娘細胞を排除し、成長した集団におけるプラスミドの維持に貢献することである。染色体中においては、TAシステムはほとんどが遺伝子水平伝搬に由来するアクセサリーゲノムの一部である。TAシステムは、プロファージ、トランスポゾン、およびその他のゲノムアイランド上で検出される。プラスミドやファージのような移動性の遺伝的要素からの保護に関わるシステムにも関わる。染色体TAシステムは、細菌の成長に一般的に作用することから、宿主の制御ネットワークに組み込まれ、ストレス管理に関与しているのではないかと考えられていた。しかし、毒素がエンドリボヌクレアーゼである5つのTAシステム(relBE, yefM-yoeB, mazEF, chpB, dinJ-yafQ)を欠損したEscherichia coli株では、ストレス条件下でも生存率が低下しなかった。さらに、この株は、野生株との競争実験においても、不利な条件を示さなかった。これらの観察結果は、ストレス管理におけるTAシステムの役割を問うものであった。最近のモデルでは、TAシステムとin vitroでの抗生物質へのpersistenceとの直接的な関係が提案された。このモデルはこの分野で瞬く間にヒットし、ここ数年のTAモジュールとpersistenceに関する研究に影響を与えた。persistenceは、細菌の生理機能を抗生物質耐性の高い状態へと導く確率的なスイッチと定義されている。パーシスター細胞は頻度が低く(菌種、菌株、実験条件、抗生物質によって10-2~10-6)、一過性の性質を持つため、研究が非常に困難である。そのため、persistenceの分子メカニズムは、まだほとんど解明されていない。TAモジュールとpersistenceを結びつけるモデルは、当初、K. Gerdesの研究室が、10個のタイプII TAシステムを連続的に欠失させると(後にΔ10株と呼ばれる)、抗生物質に対するpersistenceのレベルが徐々に低下するという観察結果から生まれた。また、さまざまな抗毒素の分解を媒介すると考えられているLonプロテアーゼをコードする遺伝子を欠失させても、同様の効果が得られた。このモデルは広く受け入れられたが、いくつかの独立した追跡調査でその有効性が疑問視された。それにもかかわらず、このモデルは、単一細胞レベルでのTAシステムの活性化とpersistenceとの関連性に焦点を当てた後続研究でさらに改良された。著者らは、(p)ppGppの確率的な蓄積が抗毒素の分解の引き金となり、TAシステムが活性化されることを報告した。本研究では、yefM-yoeBおよびrelBE TAオペロンへのgfpの融合を用いて、TAの活性化をモニターした。また、定常期のシグマ因子RpoSとmCherryの融合体を用いて、(p)ppGppの細胞内濃度をモニターした。これらのレポーターを用いて、著者らは、非蛍光細胞のバルク集団の中で、まれに存在する非増殖蛍光細胞が、高用量のアンピシリンに耐性を示すことを確認した。また、アンピシリン処理後に蛍光細胞が増殖を再開する場合もあった。これらのデータをもとに、(p)ppGppの蓄積がppx遺伝子にコードされるポリホスファターゼを阻害し、ポリリン酸(PolyP)が蓄積されることを提唱した。PolyPはLonと結合して抗毒素の分解を促進し、TA複合体から毒素を遊離させることになる。その結果、遊離した毒素は翻訳を阻害し、persistenceを引き起こすことになる。その後、K. Gerdesの研究室は、タイプII hipBAシステムのHipA毒素が、10のTAシステムを活性化することで、細菌のpersistenceを誘導することを提案し、細菌のpersistenceの主要なエフェクターとしての役割を強化した。

 このモデルの著者らは、前述の研究が行われた基準となるΔ10株が、φ80プロファージに感染していることを発見した。彼らは改訂版で、観察されたpersistenceの喪失をこれらのファージ感染に起因するとし、TAシステムと持続性を切り離して考えた。

 欠陥のあるΔ10株という概念は、このモデルを事実上崩壊させたが、改訂版では取り上げられなかった別の問題がある。このモデルがここ数年でどれほどの影響力を持っているかを考えると、これらの問題をすべて明らかにすることが最も重要である。ファージ汚染の問題が、オリジナルモデルのいくつかの側面の有効性にどのような影響を与えるのかは不明である。特に、タイプIIパーシスター細胞におけるTAシステムの確率的な活性化については、これらの実験が非感染の野生型株でのみ行われたため、不明である。また、HipA毒素が10個のTAシステムの活性化を介してpersistenceを誘導するモデルについても同様のコメントがある。そこで我々は、独自に構築したΔ10株を用い、前述の研究で用いられた蛍光レポーターを用いて、タイプIITAシステムの役割を再検討した。その結果、これまで用いられてきた方法にはいくつかの欠点があり、結果を誤って解釈してしまう可能性があることがわかった。10個のTAシステムを欠失させても、ofloxacinやampicillinに対するpersistanceに影響を与えないことが確認された。高度に変異したΔ10株以外にも、これまで使用されてきた蛍光レポーターは、TAシステムの活性化や(p)ppGppレベルを報告できなかったことを示している。そこで我々は、マイクロ流体チップと蛍光顕微鏡を組み合わせて、単一細胞レベルでyefM-yoeBシステムの誘導をモニターする新しい蛍光レポーターを設計した。興味深いことに、少数のタイプIIのパーシスター細胞が観察されたが、これらの細胞の蛍光は集団の大部分の細胞の蛍光と同程度であり、TAシステムの誘導とアンピシリンに対するパーシスターとの間には直接的な関連性がないことが確認された。

 

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