Kent AG, Vill AC, Shi Q, Satlin MJ, Brito IL.
Nat Commun. 2020 Sep 1;11(1):4379.
doi: 10.1038/s41467-020-18164-7. PMID: 32873785; PMCID: PMC7463002.
抗生物質耐性遺伝子の獲得により、多剤耐性Enterobacteriaceae や Pseudomonas aeruginosaなどの重要な病原体は、抗生物質にほとんどあるいは完全に反応しなくなった。これらいわゆる「スーパーバグ」と呼ばれる細菌は、接触したヒト腸内細菌叢のメンバーとの遺伝子水平伝搬の過程で抗生物質耐性遺伝子を獲得することが広く認められている。これら多剤耐性菌の出現は、血液学的悪性腫瘍患者に対する造血細胞移植などの救命処置を脅かしている。さらにこれらの患者に必要な抗生物質の使用は、遺伝子水平伝搬のトリガーになりうる。腸内細菌叢内の抗生物質耐性遺伝子を同定し、その機能、豊富さ、およびそれらの宿主と関連を特徴付けるためのツールが利用可能であるが、これらの患者の入院中のような比較的短期間の間、抗生物質耐性遺伝子と移動性遺伝子の細菌宿主関連をモニターしようとした研究はない。
抗生物質耐性の蔓延に対抗するためには、どの生物が移動性の抗生物質耐性遺伝子を保有し、どの生物が遺伝子水平伝搬に関与しているかを知ることが重要である。腸内の抗生物質耐性遺伝子の全体的な豊富さを特徴づける方法はあるものの、ショートリードシークエンシングの技術的限界から、細菌の分類と抗生物質耐性遺伝子をコードする特定の移動性遺伝子とを結びつけることはできなかった。移動性抗生物質耐性遺伝子の細菌宿主を決定するために、我々は単一細菌ゲノム内の長距離相互作用を見出すことを目的としてhigh-throughput chromatin conformation capture (Hi-C)法を利用した。まず個々の細胞内のDNAをホルムアルデヒドによって架橋した。その後細胞を溶解し、DNAを制限酵素でカットし、ビオチン化し、架橋したDNA間をライゲーションした。架橋を外して、ライゲーションしたDNAをプルダウンしてDNAライブラリーとし、シークエンシングを行った。このプロトコルは、細菌ゲノムのメタゲノムアセンブリを改善するために使用されている。またこの手法により、プラスミドやファージと細菌宿主の関連が同定されている。以上の通りこの方法は、宿主と可動性遺伝子の関係を明らかにでき、遺伝子水平伝搬のプロセスを調べるのに用いることができる。
我々は、健康な個人と造血幹細胞移植を受けた患者の腸内細菌叢の、特定の可動性抗生物質耐性遺伝子を保有する細菌の分類を調査するために、メタゲノムショットガンシーケンシングと組み合わせて、Hi-Cプロトコルと分析パイプラインの修正版を開発する。これらの患者は移植期間中の入院期間が長く（21日±4日）、抗生物質治療を複数回受けることが多く、多剤耐性菌感染の可能性が高くなっていた。その結果、これらの患者は、carbapenem耐性Enterobacteriaceaeまたはcarbapenem耐性P. aeruginosaの菌血症の場合、40～70％の死亡率に直面している。したがってこのケースは、多剤耐性病原体が抗生物質の下で出現または増幅する可能性がある。患者および健常者の腸内細菌叢サンプリングは、好中球移植のための入院時に開始し、好中球が移植されるまで入院中も継続して、2-3週間かけて行なった。
我々は、遺伝子と分類の関連を得るために、現在の細菌のHi-Cプロトコルにいくつかの変更を導入した。我々は、メタゲノムとHi-Cシーケンシングライブラリの組成間の一致を改善するために、サンプルの保存方法を変更し、制限酵素の選択を最適化した。また、Nextera XTシーケンシングライブラリー調製をHi-C実験プロトコルに直接統合し、操作を合理化し、サンプル調製時間を短縮した。重要なことは、腸内細菌叢のような多様な細菌群集の中では、移動性遺伝子が高度に複雑性や組換え性を持っている可能性があり、アセンブリーとリンケージ解析の両方を複雑にしていることである。そこで我々は、ゲノムをアセンブルするための計算ワークフローを実装し、大型の統合されたファージをそれぞれのコンティグに分離し、ビニングやHi-C接続を介してそれらをゲノムに関連付けた。識別可能なプラスミドを保有する3つの生物の模擬群集において、各プラスミドをその初期のゲノムにリンクさせることができた。
本研究では2人の健常者と7人の好中球減少症患者を比較することで、複数の抗生物質の投与により多剤耐性感染症の脅威に脆弱であることを明らかにした。また、好中球減少症患者では健常者と比較して、抗生物質耐性や移動遺伝子がより多様な分類群と関連しているにもかかわらず、個人間で異なる遺伝子水平伝搬のネットワークがあることを発見した。さらに、遺伝子水平伝搬は両コホートにおいて数週間に渡って頻繁に発生していることが示唆された。抗生物質耐性遺伝子の広がりを理解するためのほとんどの研究が病原菌に焦点を当ててきたのに対し、我々の発見は、このプロセスにおけるヒト腸内細菌叢の役割に光を当てるものである。
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