Springall L, Hughes CD, Simons M, Azinas S, Van Houten B, Kad NM.
Nucleic Acids Res. 2018 Feb 16;46(3):1256-1265.
doi: 10.1093/nar/gkx1244.
ゲノムは、内因性および外因性の要因によって常に攻撃を受けており、その結果、さまざまなDNA損傷が生じている。したがって、効率的なDNA修復は、すべての生物の生存に不可欠である。太陽の紫外線（UV）は、細胞毒性のあるシクロピリミジン2量体や6-4光生成物を引き起こす。これらの紫外線によって誘発されたDNA損傷は、ヌクレオチド除去修復（nucleotide excision repair: NER）によって除去される。この経路はバクテリアから哺乳類まで高度に機構的に保存されており、次のような個別のステップを経て進行する。すなわち、損傷の認識、損傷の確認、損傷部位の除去、修復部位の修正である。バクテリアでは、UvrAとUvrBが協調して損傷部位の認識を行う。UvrBは損傷部位が修復に適しているかどうかを検証する。UvrCはUvrBと結合した損傷部位に引き寄せられ、同じ鎖の損傷部位の5′と3′の両方でDNA鎖を切断する。結果として生じた12-13ntのパッチは、UvrD（DNAヘリカーゼII）によって取り除かれ、修復の最終段階の前にUvrCも再利用される。その後、UvrDはUvrCを再利用し、修復の最終段階であるDNA合成と修復パッチの修正を行う。原核生物では、DNAポリメラーゼIが一本鎖パッチを鋳型として、損傷を受けていないDNAを再合成し、その後、DNAリガーゼによって再封鎖される。
この修復モードについては、採用されている物理的探索メカニズム、パートナーの採用方法、形成される修復中間体など、多くの疑問が残されている。私たちは、単一分子法を用いて、どのようにして損傷部位が発見されるのかを調べた。UvrAとUvrBの単一分子を蛍光標識することで、これらのタンパク質が3次元ジャンプと1次元スライドを組み合わせてゲノム上の損傷部位をスキャンしていることを示した。これらの研究は、DNAタイトロープと呼ばれる高さのあるマイクロプラットフォーム上で行われ、修復中にどのような複合体が形成されるかを調べることもできた。その結果、UvrAとUvrBはUvrA2B2複合体を形成していることが示唆された。さらに、UvrBとUvrCもUvrAとは独立した複合体を形成していることが確認された。この興味深い複合体は、以前、バルク研究で同定されたが、in vitroではdsDNAに対する明らかな修復効率を示さなかった。そのため、この複合体の役割は不明のままであった。
ここでは、in vitroおよび生きた大腸菌細胞内での単一分子イメージング技術と、紫外線による細胞生存実験を組み合わせて、修復における特定の複合体の存在と役割を調べた。その結果、UvrA、UvrB、UvrCからなる「repairosome」複合体の存在を示す証拠が得られた。このような複合体は、修復に必要なすべての要素を損傷部位に集めることで、修復の効率を大幅に高めることができる。また、DNAタイトロープ上に定義された損傷を用いて、どの複合体が損傷に関連するかを明らかにすることができた。意外なことに、UvrBとUvrCの複合体（UvrBC）が損傷部位を特定できることがわかった。大腸菌UvrA-null細胞のin vivo蛍光イメージングでは、eGFPタグ付きのUvrCが紫外線にさらされるとゲノムに結合することが示された。並行して、UvrCのレベルがわずかに上昇すると、UvrA-null細胞の低用量の紫外線に対する抵抗性が高まることも示された。これらの結果から、低レベルの損傷を受けた細胞では、UvrBC複合体がUvrAとは独立してゲノムの損傷部位を特定する修復メカニズムが存在することが示唆された。
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