Understanding the coupling between DNA damage detection and UvrA’s ATPase using bulk and single molecule kinetics

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Barnett JT, Kad NM.

FASEB J. 2019 Jan;33(1):763-769.

doi: 10.1096/fj.201800899R. Epub 2018 Jul 18. PMID: 30020831; PMCID: PMC6355085.

Understanding the coupling between DNA damage detection and UvrA's ATPase using bulk and single molecule kinetics
Nucleotide excision repair (NER) protects cells against diverse types of DNA damage, principally UV irradiation. In Escherichia coli, damage is recognized by 2 ...

 ゲノムDNAは外因性および内因性の両方の原因によって常に損傷を受けており、ゲノムの完全性を維持するために効率的に修復されなければならない。ヌクレオチド除去修復(nucleotide excision repair: NER)は、進化的に保存されたDNA修復機構であり、あらゆる生命に存在する。NERは主に、シクロブタンピリミジン二量体や6-4光生成物などの紫外線による損傷を含む、嵩高い損傷を修復する。しかし、NERは無数の種類の損傷を修復するためにも利用される。NERの古典的な説明では、複数の酵素により損傷の処理が行われ、検出、切開、修復がされる。UvrAがUvrBとともに損傷の位置を確認する必要がある。UvrAはダメージの位置を確認すると、UvrABの「preincision」複合体から放出され、UvrBが単独でDNA上に残る。続いてUvrCが召集され、同一鎖上の損傷部の両側でDNA切断を行う。その後、UvrDとDNAポリメラーゼIが、損傷オリゴヌクレオチドの除去と修復再合成を行う。最後に、DNAリガーゼが残ったニックを埋める。

 大腸菌の損傷除去にはATPが必要である。UvrAの配列を解析すると、タイプAのウォーカーモチーフ部位が2つあり、1つは31~45残基目(N-terminal site)、もう1つは640~654残基目(C-terminal site)であることがわかった。2量体のUvrAの3次元構造では、1つのUvrAのN-terminal ATPase domainがもう1つのUvrAのC-terminal ATPase siteに近接している。さらに、4つのUvrAはすべて、タンパク質の表面を横切るDNA結合クレフトの下に位置している。各ATPase部位の触媒リジン残基を変異させた以前の研究では、全体のATPアーゼ活性の大幅な低下が観察された。このような変異を利用した研究では、ATPaseがUvrBのDNAへのローディングに役割を果たしていることが示唆されている。これらの研究の多くは、その結果に矛盾があるため、ATPaseのメカニズムを明確に定義し、UvrAの機能における役割を定義する必要がある。

 UvrAのATPase部位は、それぞれ異なる役割を持っていると考えられている。C末端の部位はDNA損傷を識別し、N末端の部位はUvrAの二量体形成やUvrBの結合に関与している。UvrAの定常的なATPase活性を測定したところ、DNAを結合すると活性化されることがわかった(kcat 0.71-1.07/s)。UvrAは損傷を識別する能力があるにもかかわらず、紫外線損傷を受けたDNAは定常状態のATPaseを変化させないことがわかった。我々は、mScarletで標識した大腸菌UvrAを用いたin vitro DNA tightrope assayを用いて、異なるヌクレオチド補因子がUvrAのDNAとの相互作用にどのような影響を与えるかを1分子レベルで調べた。その結果、UvrAはDNA上で3次元的な探索を行うことが確認され、その寿命はヌクレオチドの条件や紫外線損傷の有無によって変化することがわかった。ATPと紫外線損傷の存在下では、損傷を受けていないDNAと比較して、寿命が著しく長くなる。ATPターンオーバーの律速段階はDNA上で行われており、損傷の存在はUvrAのDNA結合寿命を変化させるが、定常状態のATPase速度は変化させない。このパラドックスは、UvrAが2つの部位でATPを順次加水分解すると解消されることから、UvrAは損傷認識と密接に結合した負の協調的なATPaseを持っていることが示唆された。

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