Dörr T, Vulić M, Lewis K.
PLoS Biol. 2010 Feb 23;8(2):e1000317.
doi: 10.1371/journal.pbio.1000317. PMID: 20186264; PMCID: PMC2826370.
細菌集団はパーシスターと呼ばれる休眠細胞を形成しており、この細胞は抗生物質に対して高い耐性を持っている。抗生物質による時間依存的または用量依存的な殺傷は、はっきりとした二相性を示し、パーシスターは生き残った部分集団を形成する。生き残った細胞を再接種すると、新たなパーシスターの亜集団を含む培養物が得られる。これらの細胞は突然変異体ではなく、野生型の表現型の変種であることが示されている。パーシスターを別の殺菌性抗生物質に再暴露しても、追加の殺傷はほとんどないことから、パーシスターは多剤耐性のある細胞であることが示された。大腸菌のhipA毒素遺伝子の機能獲得変異体では、生育集団におけるアンピシリンおよびフルオロキノロンに耐性のあるパーシスターの頻度が、10,000個に1個以下（野生型レベル）から100個に1個に増加する。この機能獲得変異体hipA7は、抗生物質の添加前にパーシスターを形成することを示した。これらのパーシスターは、成長の遅い、あるいは成長しない細胞であった。野生型パーシスターは、リボソームRNAプロモーターに転写融合した分解可能なGFPを発現する株のdim細胞を選別することにより、抗生物質を添加していない大腸菌の指数関数的な培養から分離された。このことから、パーシスターはタンパク質の合成が低下して休眠状態にある細胞であることがわかった。
パーシスター形成のメカニズムは現在のところ不明である。単離されたパーシスターは、染色体上の毒素／アンチトキシン（TA）遺伝子の発現レベルが増加している。mRNAエンドヌクレアーゼであるRelEの異所過剰発現は、タンパク質合成を阻害し、多剤耐性のある休眠細胞を作り出す。HipAタンパク質はEf-Tuキナーゼであり、これもタンパク質合成を阻害し、過剰生産時には多剤耐性の細胞を作り出す。しかし、個々のTA遺伝子座を欠失させた株は表現型を持たない。これは機能的な冗長性があるためと考えられる。大腸菌は少なくとも15のTAモジュールが存在する。大腸菌の3,985個のオープンリーディングフレームのノックアウトライブラリーを用いて、定常期にパーシスターを欠く変異体をスクリーニングしたところ、パーシスター形成を欠く株は1つも発見されなかった。大腸菌のトランスポゾン挿入（Tn）ライブラリのスクリーニングでは、主にグローバルな制御因子の変異体が同定された。このことは、パーシスター形成には複数の冗長なメカニズムが存在することを強く示唆している。パーシスターは、もともと1944年にBiggerによって報告されたものであるが、機能的な冗長性のために、パーシスターが形成されるメカニズムを解明することは非常に困難であった。
パーシスター形成のメカニズムの可能性を探るには、SOS応答の解析が有効な手がかりとなる。我々はこれまでに、SOS応答の1つまたは複数の構成要素が、DNAにダメージを与える抗生物質にさらされた後に、パーシスター形成を誘導することを発見している。興味深いことに、SOSは大腸菌のいくつかのTA遺伝子を誘導し、それらのプロモーターにはLexボックスが含まれている。重要なことは、3つのタイプ1のTAモジュール（symER、hokE、tisAB/istR）では、SOS誘導後に毒素遺伝子のみがアップレギュレートされると予測されるのに対し、タイプ2のTAモジュールでは、毒素とアンチトキシンがオペロンを形成しているため、両方とも誘導されると予測されることである。ciprofloxacinなどのフルオロキノロンは、DNAジャイレースとトポイソメラーゼのリガーゼ活性を阻害し、それらをエンドヌクレアーゼに変換することで、SOS応答を誘導するとされている。別の研究では、ciprofloxacinに反応してパーシスターを形成するためにも、SOS応答が必要であることを示している。
SOS応答が誘導されると、大腸菌では、ATPを減少させ、人為的に過剰発現させると細胞を死滅させるような小さな膜作用ペプチドをコードするtisB「毒素」遺伝子が発現する。私たちは、tisBが実際にはパーシスター遺伝子であり、その産物が細胞の代謝を停止させることで可逆的な休眠を誘導するのではないかと考えた。tisBをノックアウトすると、DNAに損傷を与える抗生物質ciprofloxacinに耐性のあるパーシスターの頻度が激減し、一方で、このペプチドを穏やかに過剰生産するとパーシスター形成が誘導されることがわかった。また、ciprofloxacinを段階的に投与すると、tisAB依存的にパーシスター形成が誘導され、TisB毒素を産生する細胞は複数の抗生物質に耐性を示した。すべての抗菌剤に耐性を持つパーシスターの生成は、フルオロキノロン系抗生物質の「副作用」であると考えられる。TisBは膜ペプチドで、プロトン移動力やATPレベルを低下させることが示されており、休眠細胞の形成に関与することが示唆された。今回の結果は、SOS応答によるTisBの誘導が、多剤耐性細胞の産生を制御していることを示唆しており、我々の知る限り、初めてのパーシスター形成のメカニズムである。
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