Stochastic pulsing of gene expression enables the generation of spatial patterns in Bacillus subtilis biofilms

Nadezhdin E, Murphy N, Dalchau N, Phillips A, Locke JCW.

Nat Commun. 2020 Feb 19;11(1):950.

doi: 10.1038/s41467-020-14431-9. PMID: 32075967; PMCID: PMC7031267.

Stochastic pulsing of gene expression enables the generation of spatial patterns in Bacillus subtilis biofilms - Nature Communications

Stochastic pulsing of gene expression can generate phenotypic diversity in a genetically identical population of cells. Here, the authors show that stochastic p...

　遺伝子発現の空間的なパターンは、発生において重要な役割を果たしている。多くのパターンは開始シグナルの空間的な勾配に応答して形成されるが、遺伝子発現の一過性の変動もまた、同一の細胞の集団内の遺伝子発現の違いを生成することによってパターン形成を開始することができる。個々の細菌細胞の遺伝子発現の変動は、主要な調節因子で観察されている。この変動は、抗生物質から生き残ることができるゆっくりと成長する状態を促進するなど、可変環境に対して表現型の多様性を生成し、機能的な役割を果たすと仮定されている。

　最近、遺伝的に同一の細胞の集団における表現型の多様性は、転写調節因子のパルス活性によって達成できることが明らかになってきた。重要な調節因子の確率的な脈動は、微生物から哺乳類の細胞培養に至るまで、複数の系で観察されている。しかし、多細胞系の発生における遺伝子発現の確率的パルスの役割は、まだ十分に理解されていない。ここでは、モデル多細胞系として枯草菌バイオフィルムを用いて、パターン形成時の遺伝子発現の確率的パルスの役割を調べる。

　バイオフィルムは、機能分化を含む様々な空間構造を示す複雑な多細胞システムである。枯草菌のバイオフィルムでは、運動性、胞子形成、サーファクチン産生、マトリックス形成などの不均一な細胞状態を有する空間パターンが形成されている。これらの細胞状態は、しばしば「塩と胡椒」のような形で不均一に分布しているが、バイオフィルムの特定の領域に空間的に局在しており、バイオフィルムにおけるパターン形成時の遺伝子発現における空間的シグナル伝達と変動の両方の存在を示唆している。枯草菌のプランクトン増殖条件下では、いくつかの経路の遺伝子発現において高い変動を示すことが示されている。これらの経路には、コンピテンス、マトリックス産生、胞子形成、ストレス応答が含まれている。しかし、単一細胞レベルでの遺伝子発現の確率的なパルスが、バイオフィルムの空間パターン形成にどのような役割を果たしているのかは不明である。

　本研究では、オルタナティブシグマ因子σ^B を介する枯草菌の一般ストレス応答経路をモデル系として、バイオフィルム中の動的で不均一な遺伝子発現を調べる。σ^Bはバイオフィルムにおける遺伝子制御ダイナミクスを調べるための理想的なシステムであり、その遺伝子制御ダイナミクスはマイクロコロニー中の単細胞レベルで既に解明されている。様々なストレスへの応答として、σ^B活性化状態に入ることは、休眠胞子を形成するのとは別の保護戦略と考えることができる。実際、σ^Bの活性化はプランクトン成長における胞子形成を抑制することが示されている。

　σ^Bは、エネルギーストレスと環境ストレスの2つの幅広いクラスのストレスによって活性化される。阻害剤（CCCP、MPAなど）の添加によるATP制限、定常期への移行、炭素源制限培地での培養などによってエネルギーストレスをかけることができる。エタノール、NaCl、および熱などの環境ストレスは、σ^Bを活性化することが示されている。これらの反応はプランクトン成長において特徴づけられているが、バイオフィルム形成中のσ^Bの活性化ダイナミクスは不明である。バイオフィルムは空間的に局在化したストレスパターンをつくることができ、したがってバイオフィルム形成中のσ^Bの活性化を理解するためには、個々の細胞における遺伝子発現を調べることが重要である。

　エネルギーストレス経路は、α/βヒドロラーゼRsbQとセリンホスファターゼRsbPの複合体によって媒介される。環境ストレス経路は、ホスファターゼRsbUの活性を制御するストレスソームと呼ばれる感知モジュールを介して媒介される。非ストレス条件下では、σ^Bはその抗シグマ因子RsbWと結合しているために不活性である。ストレス条件下では、RsbPまたはRsbUのいずれかが、その抗シグマ因子RsbVを脱リン酸化することでσ^Bを活性化し、RsbVが抗シグマ因子RsbWと結合してσ^Bを放出することを可能にする。エネルギーストレス経路と環境ストレス経路の制御は類似しているが、個々の細胞では驚くほど異なる活性化ダイナミクスが観察される。エネルギーストレス条件下では、アガロースパッド上で成長したマイクロコロニーにおいて、ホスファターゼRsbPを介した連続的な活性化により、σ^Bは一連の確率的なパルスで活性化される。一方、環境ストレスは、ストレスソームを介したRsbUの調節により、σ^B活性に単一の適応的パルスを発生させる。これらのパルスの発生の重要な側面は、σ^Bがσ^B、RsbV、RsbWからなる自身のオペロンを活性化することである。この結果、σ^Bの活性化による正のフィードバックループが生じ、これにより変動が増幅され、RsbWの活性化による負のフィードバックループが生じ、これによりパルスが終了する。エネルギーストレス下での同様の脈動ダイナミクスについては、最近、同様の制御構造を共有する他のオルタナティヴシグマ因子でも観察されている。

　本研究では、バイオフィルムを形成することが可能な枯草菌の単離株におけるσ^Bの発現を調べた。我々は、定量的顕微鏡とタイムラプスイメージングを用いて、バイオフィルムの発生中に個々の細胞における一般的なストレス応答シグマ因子σ^Bの活性のパルスを観察した。バイオフィルム成長条件下では、σ^Bはマイクロコロニーとバイオフィルム形成中の両方で、一連の確率的なパルスで活性化されることがわかった。さらに、枯草菌のバイオフィルムではσ^Bの活性化に勾配が見られ、バイオフィルムの最上部で発現が最も高くなることがわかった。この勾配はエネルギーストレス経路に依存している。しかし、ほとんどの胞子は、σ^Bが胞子形成を抑制することが示されているにもかかわらず、バイオフィルムの上部で発見されている。モデリングと実験を通じて、我々は、σ^Bの確率的なパルス化は、細胞がバイオフィルムの同じ領域に共存するために相互に排他的な細胞状態を可能にし、σ^Bまたは胞子形成のいずれかを活性化することができることを提案する。このように、遺伝子発現の確率的パルスは、バイオフィルムにおける単純な空間パターンの形成を可能にすることができる。