Ho HN, van Oijen AM, Ghodke H.
Nat Commun. 2020 Mar 20;11(1):1478.
doi: 10.1038/s41467-020-15182-3. PMID: 32198374; PMCID: PMC7083905.
転写鎖に生じたDNA損傷は、非転写鎖に生じた損傷よりも速い速度で修復される。この転写結合修復（transcription-coupled repair: TCR）の促進は、RNAポリメラーゼ（RNA polymerase: RNAP）が損傷センサーとして機能し、続いて転写修復カップリング因子（transcription-repair coupling factor: TRCF）に依存してヌクレオチド除去修復（nucleotide excision repair: NER）機構が動員されることに起因する。TCRは、バクテリアからヒトに至るまで、古細菌の例外を除いて高度に保存されている。
モデル生物である大腸菌では、原核生物のTRCFであるMfdが、病変部位や障害部位で停止した転写複合体を認識し、転写の終了とNER装置（UvrAB）のその部位へのリクルートを組織的に行う。Mfdは、RNAPとNERタンパク質を結合するアダプタータンパク質として機能するモジュラー型のマルチドメインタンパク質である。MfdのN末端では、ドメインD1a、D2、D1bがUvrBホモロジーモジュールを構成しており、UvrAと相互作用することができる。ドメインD3はまだ機能が解明されていない。ドメインD4は、RNAPと相互作用するドメイン（RNAP interacting domain: RID）で、RNAPのβサブユニットと相互作用する。ドメインD5/D6は、スーパーファミリー2のヘリカーゼであるRecGと相同性のあるMfdのモータードメインを構成している。このモータードメインは、Mfdが転写された鎖に対して3′-5′方向に移動するように仕向ける。最後に、ドメインD7はN末端と相互作用し、RNAPとの相互作用がない場合には、DNAと安定して結合できない自動抑制型の構造にタンパク質を固定する。
Mfdは、停滞している三元伸長複合体（ternary elongation complex: TEC）の上流側にリクルートされる。TCRでは、Mfdの自動抑制が解除され、トランスロカーゼ活性が活性化されてRNAPを追い出し、同時にUvrBホモロジーモジュールが溶液にさらされる。次に、DNAに結合してRNAPと結合したMfdが、UvrBホモロジーモジュールを介してUvrABタンパク質をリクルートする。In vitroの研究から、UvrA（さらにUvrAB）がMfd-RNAPのDNAからの解離を促進し、UvrBがDNA上でプレインシジョン複合体を形成することがわかっている。
しかし、MfdとRNAPの相互作用による成果はTCRだけではない。Mfdは、RNAPの触媒部位がRNAによって塞がれた形でRNAPがバックトラックしているクラスIIの休止部位でも、転写を再活性化することができる。光トラップを用いたin vitroの1分子実験では、Mfdがビーズとカバースリップの間に固定されたフォーク状のDNA基質上を移動することが明らかになった。さらに、二重光学トラップ実験では、「放出とキャッチアップ」のメカニズムが明らかになった。つまり、移動してきた1つのMfdは、rNTPsの存在下でヌクレオチド不足の失速したTECを再活性化し、次の失速/休止部位でRNAPに再遭遇するまでDNA上を移動し続けるのである。現在のところ、NER因子がこれらの部位にリクルートされることを示唆する実験的証拠はない。
生きている大腸菌の中で、MfdがRNAPや下流の修復因子UvrABとどのように相互作用しているのかを理解するために、野生型の機能を維持したまま蛍光標識したMfd-YPet融合体を作製した。その結果、Mfdは細胞内で自己抑制されており、RNAPとの相互作用がない状態で極めて一時的なDNA結合を示すことがわかった。さらに、RNAPとの相互作用は、RNAPを失速させる薬剤（CBR703）の存在下では促進され、転写阻害剤であるrifampicinで処理した細胞では見られない。自由に拡散する細胞質のMfdと、RNAPと安定的に相互作用するMfd分子の量から、Mfdは正常な成長期には転写しているRNAPの一部にしか関与していないことがわかった。この結果は、Mfdの基質を示すin vitroの広範なデータと一致する。すなわち、病変部位で停止したRNAP、ロードブロック、クラスII休止部位で後退したRNAPである。Mfdは、核酸付加サイクルを活発に実行しているTECとは相互作用しないことが知られているため、今回のin vivoでの観察は、内因性の病変部位である可能性のある、上述の方法で一時停止または停滞しているストレスを受けたTECとの相互作用を反映しているのではないかと考えた。Mfdの結合寿命を測定したところ、UvrAの存在に完全に依存していることがわかった。UvrAを欠損した細胞では、Mfdの寿命はUvrA+細胞のそれよりも長く（約29秒）、病変部位におけるTCRのin vitroでの1分子再構成実験で得られた測定値と一致した。また、RNAPとUvrAに依存したMfdの相互作用が正常な成長細胞で多数観察されたことは、TCRがハウスキーピング的なDNA修復経路であるという主張と一致する。ジェノトキシンにさらされた細菌細胞は、SOS応答を引き起こし、NER因子の発現を急速に増加させる。UvrABは、Mfdとは独立して染色体DNAを検索し、修復を引き起こすことができるため、SOS誘導後にTCRからのシグナルを観察することは困難である。これらの理由から、TCRの観察は、SOSを起こさない条件で行うのが最適であるとも言われている。
細胞内でのMfdとRNAPおよびUvrABタンパク質との相互作用の本質に関する重要な疑問は、現在のところ解決されていない。すなわち、転写ストレスとNERの接点で形成されるハンドオフ複合体の正体は何か、その形成と解決にはどのような触媒作用が必要なのか、という問いである。本研究では、細胞内でDNAに結合した修復因子の結合寿命を確実に測定する方法を用いて、UvrAのATPase変異体およびUvrBの損傷認識変異体の、MfdのDNA結合寿命を測定した。その結果、UvrAまたはUvrBの変異体を発現させた細胞では、野生型の細胞に比べてMfdが安定してDNA上に留まることがわかった。この結果から、野生型の細胞では、UvrAによるATPの加水分解とUvrBの安定的な搭載により、Mfdの解離速度が大幅に向上することがわかった。また、UvrBを欠損した細胞ではUvrAが停止していることから、転写修復カップリング因子と細胞内の修復機構との相互作用について、「解離の促進」モデルを提案した。UvrBがUvrAを介してDNAにロードされることで、MfdとUvrAの解離が促進され、ハンドオフが完了するというこのモデルは、失速部位における修復装置の鎖および部位特異的なローディングのエレガントなメカニズムを提供する。
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