Beyond Toxin Transport: Novel Role of ABC Transporter for Enzymatic Machinery of Cereulide NRPS Assembly Line

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Gacek-Matthews A, Chromiková Z, Sulyok M, Lücking G, Barák I, Ehling-Schulz M.

mBio. 2020 Sep 29;11(5):e01577-20.

doi: 10.1128/mBio.01577-20. PMID: 32994334; PMCID: PMC7527721.

Beyond Toxin Transport: Novel Role of ABC Transporter for Enzymatic Machinery of Cereulide NRPS Assembly Line | mBio
This study revealed a novel, potentially conserved mechanism involved in the biosynthesis of microbial natural products, exemplified by the mitochondrial active...

 非リボソームペプチド合成酵素(nonribosomal peptide synthetase: NRPS)は、抗生物質(ペニシリン、バンコマイシンなど)、抗腫瘍剤(ブレオマイシン、クリプトフィシンなど)、免疫抑制剤(シクロスポリンなど)、シデロフォア(例:エンテロバクチンなど)、毒素(例:マイクロシスチン、セレウリドなど)など様々な生理活性天然化合物の合成する細菌および真菌の多分子メガエンザイムである。これら生体内酵素の生合成機構を理解することは最も重要である。各NRPSモジュールは、認識、活性化、および選択されたモノマーの縮合を担当し、少なくともアデニル化ドメイン、ペプチジルキャリアタンパク質ドメイン、および縮合ドメイン(それぞれAドメイン、PCPドメイン、およびCドメイン)から構成されている。Aドメインは、成長するペプチドの前駆体を認識し活性化する選択的な「ゲートキーパー」として作用する。一方、PCPドメインは、チオエステル中間体を形成するためにAドメインと相互作用し、ペプチドシャトルとして機能し、中間体をAドメインとCドメインの間で移動させる。後者のドメインは、隣接するモジュールからの2つの基質間のペプチド結合形成を触媒する。これらの必須ドメインに加えて、NRPSは、エピメラーゼ、メチラーゼ、およびケトレダクターゼ(E、M、およびKRドメイン)などのさらなるドメインを保持することができ、ペプチド生成物の多様性を増加させる。多くのNRPSの最後のモジュールは、最終生成物の放出を触媒する末端チオエステラーゼ(TE)ドメインを含んでいる。NRPSドメインの構造と機能の解読にはかなりの進歩が見られたが、これらの大きく非常に動的で柔軟性のある多酵素機構が、どのようにして宿主細胞内で安定化され、組織化されて、NRPSドメインを協調し、正しい生成物合成を確実にするのかということについて、依然として不明である。

 特筆すべきは、NRPS遺伝子クラスターは頻繁にATP結合カセット(ABC)トランスポーターを保持しており、これはペプチドの輸出および/または自己抵抗性に関与していることが報告されている。ABCトランスポーターは、すべての生命で見られるタンパク質のスーパーファミリーであり、保存された構造を特徴としている。典型的には、2つの膜貫通ドメインと2つのヌクレオチド結合ドメインから構成され、それぞれ基質とATP結合に関与している。薬剤耐性や二次代謝物輸出におけるABCトランスポーターの役割は確立されている。毒素、抗生物質、シデロフォアなどの非リボソーム性二次代謝物の生合成にもABCトランスポーターが関与している可能性が示唆されているが、その根底にあるメカニズムは明らかにされていない。

 Bacillus cereusは、2つの異なるタイプの食中毒を引き起こす日和見性ヒト病原体である。様々な腸内毒素が下痢型と関連している。一方、嘔吐型はデプシペプチド毒素セレウリドによって引き起こされる。B. cereusグループのメンバーの間で広く分布しているリボソームで翻訳される腸内毒素とは対照的に、非リボソーム的に組み立てられるデプシペプチドセレウリドの産生は、一部のB. cereus株に限定されている。嘔吐性のB. cereusでは、非常に生理活性が高く強力なミトコンドリア毒素セレウリドの組み立てを担うセレウリド(Ces)NRPSをコードする遺伝子座の一部であるABCトランスポーターが同定されている。セレウリドに汚染された食品を摂取すると嘔吐を引き起こし、横紋筋融解症、肝障害、重篤な多臓器不全を引き起こすことがあり、その結果、時折死亡者が出ることがある。セレウリド合成酵素ces遺伝子は、pCER270病原性メガプラスミドに局在するオペロン内に組織化されており、そのバックボーンはBacillus anthracis毒素プラスミドpX01と共有されている。cesオペロンは、NRPSの活性化に関与するホスホパンテニルトランスフェラーゼ遺伝子(cesP)、II型チオエステラーゼ遺伝子(cesT)、構造的NRPS遺伝子(cesAB)、およびABCトランスポーター(cesCD)を含む。以前に示されたように、cesPの上流にある中央プロモーターによってポリシストロン的に転写されるcesPTABCD遺伝子の発現は、異なる調節領域を含む緊密に調節されたプロセスである。cesCD を欠失させるとセレウリドの生合成ができなくなるが、変異株では cesAB 合成酵素の転写や翻訳は影響を受けないことから、ABC トランスポーター CesCD がセレウリドの生合成に不可欠な役割を果たしていることが示唆される。

 非リボソームペプチド生合成におけるABCトランスポーターの役割を明らかにするために、我々はCesCDトランスポーターとCesAB合成酵素の特定のドメインとの間の相互作用の可能性をin vitroおよびin vivoで検証した。これらの研究は、ABCトランスポーターCesCDとCesAB合成酵素の直接的な相互作用の証拠を提供し、異種宿主としてBacillus subtilisを用いたin vivoコロケーション実験によって補完された。CesCD の変異により CesCD 複合体の集合体が破壊されると、CesAB との相互作用が低下し、結果としてセレウリドの生合成に悪影響を及ぼすことが示唆された。また、CesAB合成酵素の中でCesCと相互作用する特定のドメインを同定した。これらの結果より、このABCトランスポーターが非リボソームペプチドの生合成に直接関与していることを示唆している。今回発表された遺伝学的および生化学的データは、潜在的に重要な二次代謝物生合成の十分に理解されていなかった側面に光を当てた。

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